Rhizobia sebagai bakteri penambat nitrogen simbiotik juga menghasilkan fitohormon Indole Acetic Acid (IAA) yang mampu merangsang perkembangan akar. Aplikasi rhizobia dalam revegetasi lahan bekas tambang diperlukan untuk menghadapi kondisi tapak yang miskin unsur hara dan kepadatan tanah tinggi. Penambatan nitrogen dan produksi IAA oleh Rhizobia diharapkan membantu pertumbuhan tajuk dan akar tanaman. Namun demikian, produksi hormon IAA oleh rhizobia bervariasi tergantung jenis bakteri, kondisi media pertumbuhan dan lama inkubasi supernatan setelah penambahan reagen Salkowski. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan pengaruh lama inkubasi supernatan yang berasal dari kultur rhizobia setelah penambahan reagen Salkowski terhadap produksi IAA. Isolat bakteri rhizobia dari lahan bekas tambang nikel ditumbuhkan pada media Luria Bertani selama 7 hari. Supernatan yang terbentuk kemudian diinkubasi selama 30, 60, 90 dan 120 menit setelah penambahan reagen. Hormon IAA yang dihasilkan kemudian diukur menggunakan spektrofotometer UV-Visible. Hasil pengujian menunjukkan sebanyak 31 isolat dari 40 isolat Rhizobia yang diuji menghasilkan hormon IAA tertinggi pada inkubasi selama 120 menit. Hal ini mengindikasikan semakin lama supernatan bereaksi dengan reagen maka IAA yang terbentuk juga semakin banyak. Waktu inkubasi yang menghasilkan hormon IAA tertinggi ini dapat dijadikan dasar untuk tahap uji produksi IAA oleh rhizobia selanjutnya.