Sarang Semut (Myrmecodia pendans) merupakan tanaman yang tumbuh menempel pada beberapa jenis tanaman kayu dan memiliki kandungan yang dapat dimanfaatkan sebagai obat berbagai macam penyakit. Khasiat tersebut membuat peminatnya terus meningkat, sehingga dimungkinkan untuk melakukan perbanyakan. Namun perbanyakan secara vegetatif dan generatifmemiliki kendala, seperti semut Iridomyrmex cordatus yang memakan benih dan sifat anakan benih tidak sama dengan induknya. Kultur in vitro adalah metode perbanyakan tanaman yang dapat digunakan dalam mengatasi masalah yang ada, karena dapat memperbanyaktanaman yang sulit diperbanyak dalam waktu cepat dan memilikikeseragaman genetik. Medium kultur in vitro biasanya menggunakan bahan kimia sintetis yang memerlukan biaya relatif mahal. Sebagai alternatif pengganti yang lebih ekonomis, Pumpkins dapat digunakan sebagai medium substitusi pada medium perbanyakan in vitro. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kultur In Vitro, UMY dengan tujuan mengetahui pengaruh Pumpkins danmenentukan konsentrasi Pumpkins yang paling tepat digunakan untuk perbanyakan tanaman Sarang Semut secara in vitro. Metode yang digunakan yaitu eksperimen dan disusun dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang terdiri dari 10 perlakuan dengan 3 ulangan dan 3 sampel tiap ulangan, sehingga didapatkan 90 unit percobaan. Perlakuan yang digunakan yaitu konsentrasi Pumpkins 20g/L sampai 160g/L yang dikombinasi dengan pupuk daun 3g/L dan air kelapa 150ml/L. Hasil penelitian menunjukan penggunaan Pumpkins yang dikombinasi dengan pupuk daun dan air kelapa dapat mensubstitusi medium MS dalam perbanyakan tanaman Sarang Semut secara in vitro dan penggunaan Pumpkins konsentrasi 20 g/L memberikan pertumbuhan tanaman Sarang Semut yang lebih baik dalam perbanyakan secara in vitro.